样本处理及要求

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20

分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融.

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000

×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融.

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞

会影响测量结果）,称重后将组织剪碎.将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量

体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记

录.推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨.为了进一步裂

解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融.后将匀浆液于5000×g离心5~10

分钟,取上清检测.

4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置

于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融.订购联系当地经销商 技术：经销商转厂家

注：标本溶血会影响后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测.

需要而未提供的试剂和器材

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL 2-20uL 20-200uL 200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

试剂盒组成

名称 96 孔配置 48 孔配置 备注

微孔酶标板 12 孔×8 条 12 孔×4 条 无

标准品 0.3mL*6 管 0.3mL*6 管 无

样本稀释液 6mL 3mL 无

检测抗体-HRP 10mL 5mL 无

20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释

底物 A 6mL 3mL 无

底物 B 6mL 3mL 无

终止液 6mL 3mL 无

封板膜 2 张 2 张 无

说明书 1 份 1 份 无

自封袋 1 个 1 个 无

备注：

1. 标准品浓度依次为：48 24 12 6 3 1.5 nmol/L

2. 经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,实验过程中

直接取50μL样本上样即可.当有部分样本值超过大标准品浓度时,可用样本稀释液将标本

进行适当稀释后再进行实验.

注意事项

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果.所有试剂都必须在使用前达到室

温 20-25℃.使用后立即冷藏保存试剂.

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果.在加入底物前确保尽量吸干孔内液体.温育过程中

不要让微孔干燥掉.

3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响 OD 值.

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用.

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果.

6. 在储存和温育时避免强光直接照射.订购联系当地经销商 技术：经销商转厂家

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上.

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体.任何漂白成分都会破坏

试剂盒中反应试剂的生物活性.

9. 不能使用过期产品.

10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置.

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用.

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水.

操作步骤

1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回 4℃.

2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL；

3. 样本孔中加入待测样本 50μL；空白孔不加.

4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体

100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育 60min.

5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液（350μL）,静置 1min,甩去洗涤液,吸水

纸上拍干,如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）.

6. 每孔加入底物 A B 各 50μL,37℃避光孵育 15min.

7. 每孔加入终止液 50μL,15min 内,在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值.

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